Получение витаминов в и а

Среди биологически активных веществ, необходимых для нормального развития организма животных, одно из первых мест занимают витамины. Важное значение витаминов объясняется их участием в биохимических реакциях, способностью служить катализаторами процессов, обеспечивающих обмен веществ в организме и его связь с окружающей средой.

Витамины — низкомолекулярные органические соединения, присутствующие в живых клетках в низких концентрациях и являющиеся компонентами энзиматических систем, ответственных за различные реакции.

Производство витаминов осуществляется следующими основными путями:

1. Экстракция витаминных препаратов из растительного или животного сырья. С этого направления начиналась витаминная промышленность, поскольку первые витаминные препараты были получены именно таким путем. Например, витамин В12 получали из сырой печени крупного рогатого скота, каротин — из моркови. Но в настоящее время доля витаминов, получаемых этим методом, незначительна ввиду очень низкого содержания их в природном сырье и ограниченности сырьевых ресурсов.

2. Химический синтез витаминов. Производство синтетических витаминов занимает, пожалуй, ведущее место в современной витаминной промышленности, поскольку основная номенклатура витаминных препаратов представлена веществами, полученными химическим синтезом из химических видов сырья или сочетанием химического синтеза с биосинтезом. Однако такой способ производства витаминов представляет собой сложный, многоступенчатый процесс, сопряженный с большими производственными затратами, что делает конечные продукты слишком дорогими.

3.Биосинтез витаминов. Некоторые витамины, имеющие сложное строение, химический синтез которых в крупномасштабном производстве невозможен или экономически нецелесообразен, получают исключительно биосинтезом, с применением микроорганизмов, способных к сверхсинтезу и накоплению определенных витаминов. Примером может служить производство цианкобаламина (витамина В12). Микробиологический синтез применяется также в производстве витаминных концентратов, предназначенных для сельского хозяйства, поскольку в данном случае обычно в индивидуальном чистом виде витамины не выделяют.

Следует отметить условность такого деления витаминной промышленности. Производство некоторых витаминов включает и химические стадии и стадии биотрансформации с применением микроорганизмов (например, производство аскорбиновой кислоты). Витамин рибофлавин получают и синтетическим и микробиологическим путями. Некоторые витаминные препараты (например, витамин D2) получают путем химической модификации провитаминов или витаминов, выделенных из растительных клеток или органов животных.

Использование витаминов в качестве добавок в корма животных требует крупномасштабного производства, поэтому возникла необходимость в более дешевых способах изготовления витаминов. Таким перспективным способом получения ряда витаминов оказался микробиологический синтез.

Для нормальной деятельности организма животных и птиц необходимо включать в рационы витамины A, D, К, группы В и др.

Микробиологическая промышленность нашей страны выпускает кормовые препараты витаминов В2 и B12. Кроме того, микробиологическим можно считать и производство витамина D2, который образуется из эргостерина при облучении ультрафиолетовым светом кормовых дрожжей.

Микроорганизмы содержат много различных витаминов, которые чаще всего являются компонентами ферментов. Состав и количество витаминов в биомассе зависят от биологических свойств культуры микроорганизмов и условий их культивирования. Так, кормовые дрожжи, получаемые на гидролизатах древесины и углеводородах, сравнительно богаты витаминами группы В и содержат (в расчете сухую биомассу) следующие витамины (мг/кг):

Тиамин (В1) — 15-18

Рибофлавин (В2) — 45-68

Биотин — 1,6-3,0

Инозит — 400 -5000

Фолиевая кислота — 3,4-21,5

Никотиновая кислота — 440-610

Продукцию микроорганизмами отдельных витаминов можно увеличить, изменяя состав питательной среды. Например, количество витамина В2 (рибофлавина) в биомассе дрожжей зависит от интенсивности аэрации и содержания железа в среде.

На содержание витаминов в клетках дрожжей заметное влияние оказывают микроэлементы. Так, небольшие добавки марганца способствуют накоплению в клетках дрожжей инозита, а повышенные дозы кобальта приводят к увеличению содержания витамина В6 (пиридоксина).

Производство кормового концентрата витамина В2 (рибофлавин).Витамин В2 входит в структуру многих ферментов, в составе которых участвует в клеточном дыхании, синтезе белков и жиров, регулировании состояния нервной системы, функции печени и т.д. При его недостатке резко замедляется рост, нарушается белковый обмен.

Суточная потребность в витамине В2 составляет для птиц 3 — 4 г (кристаллического препарата) на 2 т корма, а для свиней 10 — 15 мг на 100 кг живой массы.

В природных условиях источниками рибофлавина являются высшие растения, дрожжи, мицелиальные грибы и бактерии. Большинство микроорганизмов образуют свободный рибофлавин.

В 30-е годы XX в. был найден суперпродуцент витамина — микроскопический гриб Eremothecium ashbyii, образующий до 6000 мкг рибофлавина на 1 г сухого вещества культуральной жидкости.

Для получения витамина В2 можно также использовать культуру дрожжей, ацетобутиловые бактерии, продуцент лизина Brevibakterium и др.

Микроорганизмы — продуценты рибофлавина

Технология получения кормового препарата витамина В2 микробиологическим способом достаточно проста. В качестве микроорганизма-продуцента обычно используют Е. ashbyii.

Технологический процесс производства состоит из трех основных стадий:

1. Аэробная ферментация.

2. Термолиз и концентрирование.

3. Сушка, размол, гранулирование и упаковка.

Посевной материал и стерильный воздух получают по типовой, для многих микробиологических производств, схеме. Ферментация осуществляется в типовых биореакторах объемом 63 — 100 м3 в стерильных условиях при температуре 28 — 30 °С.

Основными ингредиентами питательной среды являются соевая мука, меласса, технический жир и минеральные соли (СаСОз, КН2Р04). Продуцент витамина В2 выращивают также на средах, где источником углерода является глюкоза, сахароза, крахмал, пшеничная мука. В качестве источника азота используют молочную сыворотку, рыбную и кукурузную муку или экстракт, казеин. Развитие гриба-продуцента стимулируется добавлением ненасыщенных жирных кислот, биотина, тиамина, инозита, ростовых веществ, содержащихся в зародыше пшеницы, картофельном соке и дрожжевом автолизате.

Известно использование в производственных условиях питательной среды следующего состава:

— 1 — 3 % мелассы, гидрола или глюкозы;

— 3 — 8 % кукурузного экстракта или дрожжевого автолизата;

— добавки N, Mg, Zn.

Культивирование продуцента проводят поверхностным или глубинным способом. Витамин накапливается в клетках гриба-продуцента, либо в виде предшественника — флавина дениннуклеотида, либо в свободном состоянии.

Время культивирования длится 60 — 80 ч до начала лизиса мицелия гриба и образования спор (определяется микроскопически). При этом содержание рибофлавина в культуральной жидкости достигает 1200 мг/л.

Для сохранения штамма Е. ashbyii в активном состоянии рекомендуется производить систематический его рассев на твердые питательные среды и отбирать колонии наиболее .интенсивно окрашенные в оранжевый цвет. Яркая окраска колонии коррелирует с высокой способностью к синтезу рибофлавина.

При подготовке инокулята гриб пересевают последовательно по схеме:

посев на скошенную агаризованную среду в пробирке > жидкая среда > колба > бутыль > инокулятор

Винокуляторе культуру выращивают в течение 21-26 ч. затем ее переводят а биореактор с питательной средой, содержащей кукурузную и соевую муку, кукурузный экстракт, свекловичный сахар, КН2РО4, СаСОз, NaCl и технический жир.

Среду стерилизуют в смесителе при 120 – 122 °С в течение 1 часа. Культивирование в биореакторе ведут до начала лизиса клеток и появления спор (определяют микроскопически). Температура культивирования 28 — 30 °С, давление воздуха в биореакторе (1 — 2) — 104 Па, расход воздуха 1,5 -2,0 л в минуту на 1 л культуральной жидкости. Выход рибофлавина около 1200 мг/л.

По окончании процесса ферментации культуральную жидкость вместе с мицелием передают в вакуум-выпарные аппараты (10), где ее нагревают до 80 °С с целью разрушения (термолиза) клеточных структур и одновременно ведут процесс концентрирования (упаривания) до содержания сухих веществ 30-40 %.

Полученный после упаривания концентрат в виде сиропообразной биомассы высушивают в распылительной сушилке до содержания влаги не более 8 %. В результате получают смесь биомассы мицелия Е. Ashbyii и сухих остатков питательной среды. Для получения однородного товарного продукта смесь размалывают и просеивают. На современных предприятиях концентрат гранулируют, поскольку порошкообразный продукт сильно пылит, что создает неудобства работы с ним и приводит к его потерям.

Кормовой концентрат витамина В2 представляет собой обработанную, высушенную, размолотую или гранулированную биомассу гриба-продуцента Е. ashbyii, содержащую не менее 15 мг рибофлавин на 1 г вещества. Помимо витамина В2, концентрат содержит 0,3- 0,5 % других витаминов группы В (В1, В6, В12, никотинамид), около 20% белковых веществ, а также полисахариды, липиды, минеральные соли.

Для животноводства можно получить кормовой рибофлавин как отход при производстве ацетона. Продуцентами витамина при этом являются ацетобутиловые бактерии.

Преимущество и рентабельность микробного синтеза витамина В2 иллюстрируется следующими цифрами: из 1 т моркови получают 1г витамина, из 1 т тресковой печени — 6 г, а из 1 т культуральной жидкости гриба E.ashbyii — 25 кг.

Производство витамина В12(цианкобаламина).Среди неполимерных биологически активных соединений витамин В12 имеет самое сложное строение. Его принятое химическое название α-(5.6-диметилбензимидазолил)-кобамидцианид. Это единственный витамин, в структуру которого входит кобальт.

Организм животных не способен к самостоятельному синтезу витамина В12. Этот витамин полностью отсутствует в растительных кормах в относительно небольших количествах содержится в кормах животного происхождения (рыбной и мясо-костной муке, молочных отходах). Среди растительного мира витамин В12 был обнаружен лишь у нескольких видов высших растений (горох, фасоль, побеги бамбука), причем его происхождение в этих растениях окончательно не установлено.

Цианокобаламин обладает высокой биологической активностью с широким спектром действия. В первую очередь, витамин B12 необходим для нормального кроветворения и созревания эритроцитов, он является эффективным противоанемическим препаратом. Цианкобаламин применяют для лечения злокачественного малокровия, железодефицитных анемий, апластических анемий и т.п. Этот препарат назначают также при лучевой болезни, заболеваниях печени, полиневритах, болезни Дауна, детском церебральном параличе и многих других заболеваниях.

Для медицинских целей субстанцию витамина B12 получают в виде кристаллического тёмно-красного порошка, содержащего не менее 99% основного вещества. Из этой субстанции готовят различные лекарственные формы, из которых наиболее широкое применение находят цианкобаламин в изотоническом растворе хлорида натрия для инъекций, и таблетки, содержащие цианкобаламин и фолиевую кислоту.

Важное значение витамин B12 имеет для животноводства. Его недостаток тормозит рост животных и приводит к серьезным заболеваниям. Цианкобаламин повышает усвояемость белка растительных кормов и является необходимым фактором полноценного питания животных.

Для животноводства отечественной промышленностью выпускается кормовой концентрат витамина В12 (КМВ-12), который по эффективности не уступает кристаллическому препарату, но является более дешевым и доступным для широкого использования в сельском хозяйстве.

Полный химический синтез витамина В12 был осуществлен через 25 лет после его открытия Р. Вудвордом и А. Эшенмозером с участием большой группы исследователей нескольких лабораторий университетов и научных центров США, Англии, Франции, Японии. Конечно, химический синтез витамина В12 имеет чисто теоретическое значение и в настоящее время он не может рассматриваться как вариант промышленного производства этого важного препарата.

Единственным способом получения витамина В12 в промышленном масштабе является его микробиологический синтез с использованием специальных штаммов микроорганизмов, способных активно продуцировать этот витамин.

В природе витамин В12 синтезируют многие микроорганизмы (например, метанобразующие и пропионовокислые бактерии), а также бактерии,осуществляющие термофильное метановое сбраживание сточных вод.

Активно продуцируют витамин В12 представители рода Pzopionibacterium, природные штаммы которых образуют 1,0 — 8,5 мг/л цианокобаломина, а полученный искусственный мутант P. shermanii M-82 способен накапливать витамин В12 до 58 мг/л.

Практический интерес для микробиологического синтеза этого витамина имеют представители актиномицетов и родственных микроорганизмов. Истинный витамин B12 в значительных количествах синтезируют Nocardia rugoza (до 18 мг/л), а также представители рода Miromonospora. Высокой кобаламинсинтезирующей активностью обладают метаногенные бактерии, например, Methanosarcina barkeri, M. vacuolita и отдельные штаммы галофильного вида Methanococcus halophilus (до 16 мг/л).

Цианкобаламин синтезируют строго анаэробные бактерии из рода клостридий. В значительных количествах образуют витамин B12 ацетогенные клостридии C.thermoaceticum, C.formicoaceticum и Acetobacter woodi, синтезирующие ацетат из СО2.

Известны активные продуценты витамина Bi2 переди псевдомонад. Некоторые штаммы Pseudomonas denitrificans нашли применение для промышленного получения цианкобаламина (фирма Merk, США). Интерес представляют также термофильные бациллы, а именно Bacillus eirculans и Bacillus stearothermophilus, которые растут при температурах, соответственно, 60 °С и 75 °С и за 18-24 культивирования без соблюдения стерильных условий дают высокие выходы витамина.

В нашей стране в качестве основного продуцента витамина В12, получаемого для медицинских целей, используют культуру Propionibacterium shermanii, а для нужд животноводства применяют смешанную культуру, содержащую термофильные метанобразующие бактерии.

На большинстве зарубежных предприятий витамин В12выпускают в чистом кристаллическом виде и применяют в животноводстве большей частью в виде компонентов премиксов.

Указанный способ включения витамина В12 в кормовые рационы применяется и в нашей стране.