Методы анализа витаминов группы в
Содержание: стр:
Введение……………………………………………………………2
1. Общий обзор методов определения витаминов…………………3
2. Хроматографические методы определения витаминов…………5
3. Электрохимические методы определения витаминов…………10
4. Инверсионно вольтамперометрический метод определения
водорасторимых витаминов B1 B2 в пищевых продуктах………..13
Заключение…………………………………………………………18
Введение
В настоящее время на рынке появилось огромное количество витаминизированных продуктов питания для человека и кормов для животных, представляющих собой сухие многокомпонентные смеси. Ассортимент таких продуктов представлен достаточно широко. Это, прежде всего, биологически активные добавки к пище, премиксы, комбикорма для животных и птиц, поливитаминные препараты. Критерием качества таких продуктов может являться их анализ на содержание витаминов и, особенно, таких жизненно необходимых, как водорастворимые и жирорастворимые витамины, количество которых регламентируется нормативными документами и санитарными нормами качества.
Для определения витаминов применяют различные методы. Широко используемые оптические методы анализа трудоемки, требуют больших затрат времени и дорогостоящих реактивов, применение хроматографических методов осложнено использованием дорогостоящего оборудования. С каждым годом расширяется ассортимент и увеличивается производство продуктов питания, совершенствуется рецептура детского питания. Это в свою очередь предъявляет повышенные требования к контролю за качеством выпускаемой продукции и совершенствованию методов определения витаминов. Медико-биологические требования и санитарные нормы качества продовольственного сырья и пищевых продуктов характеризуют пищевую ценность большинства видов и групп продуктов детского питания различного назначения.
1. Общий обзор методов определения витаминов
Почти все витамины легко подвергаются окислению, изомеризации и разрушаются под воздействием высокой температуры, света, кислорода воздуха, влаги и других факторов.
Из существующих методов определения витамина С (аскорбиновой кислоты) наиболее широко применяют метод визуального и потенциометрического титрования раствором 2,6-ди-хлорфенолиндофенола по ГОСТ 24556—81, основанный на редуцирующих свойствах аскорбиновой кислоты и ее способности восстанавливать 2,6-ДХФИФ. Темно-синяя окраска этого индикатора при добавлении аскорбиновой кислоты переходит в бесцветную. Важное значение имеет приготовление экстракта исследуемого продукта. Наилучшим экстрагентом является 6 %-ный раствор метафосфорной кислоты, который инактивирует аскорбинотоксидазу и осаждает белки.
Каротин в растительном сырье, концентратах и безалкогольных напитках контролируют физико-химическим методом по ГОСТ 8756.22—80. Метод основан на фотометрическом определении массовой доли каротина в растворе, полученном в процессе экстрагирования из продуктов органическим растворителем. Предварительно раствор очищают от сопутствующих красящих веществ с помощью колоночной хроматографии. Каротин легко растворяется в органических растворителях (эфир, бензин и др.) и придает им желтую окраску. Для количественного определения каротина используют адсорбционную хроматографию на колонках с окисью алюминия и магния. Такое определение пигментов на колонке зависит от активности адсорбента, количества пигментов, а также присутствия других компонентов в разделяемой смеси. Сухая смесь окиси алюминия задерживает каротин, а влажная пропускает в раствор другие красящие вещества.
Тиамин в основном находится в связанном состоянии в виде дифосфорного эфира — кокарбоксилазы, которая является активной группой ряда ферментов. С помощью кислотного гидролиза и под воздействием ферментов тиамин освобождается из связанного состояния. Этим способом определяют количество тиамина. Для расчета содержания витамина B1 используют флюрометрический метод, который применяют для определения тиамина в пищевых продуктах. Он основан на способности тиамина образовывать в щелочной среде с феррнцианндом калня тиохром, который дает интенсивную флюоресценцию в бутиловом спирте. Интенсивность процесса контролируют на флюорометре ЭФ-ЗМ.
В продуктах питания и напитках рибофлавин присутствует в связанном состоянии, т. е. в форме фосфорных эфиров, связанных с белком. Чтобы определить количество рибофлавина в продуктах, необходимо освободить его из связанного состояния путем кислотного гидролиза и обработки ферментными препаратами. Витамин B1 в безалкогольных напитках рассчитывают с помощью химического метода для определения количества легкогидролизуемых и прочно связанных форм рибофлавина в тканях. Метод основан на способности рибофлавина к флюоресценции до и после восстановления его гипосульфитом натрия. Определение общего содержания фенольных соединений. Для этого используют колориметрический метод Фолина — Дениса, который основан на образовании голубых комплексов при восстановлении вольфрамовой кислоты под действием полифенолов с реагентом в щелочной среде. Фенольные соединения определяют по хлорогеновой кислоте методом пламенной фотометрии на приборе ЕКФ-2.
2. Хроматографические методы определения витаминов
В последнее время за рубежом бурное развитие переживает метод высокоэффективной жидкостной хроматографии. Это связано, прежде всего, с появлением прецизионных жидкостных хроматографов, совершенствованием техники выполнения анализа. Широкое использование метода ВЭЖХ при определении витаминов нашло отражение и в числе публикаций. На сегодняшний день более половины всех опубликованных работ по анализу как водо- так и жирорастворимых витаминов посвящено применению этого метода.Широкое распространение при определении витаминов получили различные варианты хроматографии.
Для очистки токоферола от посторонних примесей используют метод тонкослойной хроматографии В сочетании со спектрофотометрическими и флуориметрическими методами этим способом проводят и количественное определение витамина Е. При разделении используют пластинки с силуфолом , кизельгелем
Метод газовой хроматографии рекомендован Государственной Фармакопеей (ГФ XI) для анализа масляных растворов а-токоферола ацетата. Этим способом определяют витамин Е в виде гептафторбутирильных производных и в пищевых продуктах.
Анализ изомеров токоферола в оливковом масле проводится методом газо-жидкостной хроматографии. Методики анализа ГХ и ГЖХ требуют получения летучих производных, что крайне затруднительно при анализе жирорастворимых витаминов. По этой причине данные способы определения не получили большого распространения. Определение витамина Е в пищевых продуктах, фармпрепаратах и биологических объектах проводят в градиентном и изократическом режимах как в нормально-фазовых, так и в обращенно-фазовых условиях. В качестве адсорбентов используют силикагель (СГ), кизельгур, силасорб , ODS-Гиперсил и другие носители. Для непрерывного контроля состава элюата в жидкостной хроматографии при анализе витаминов и увеличения чувствительности определения используют УФ (А,=292 нм), спектрофотометрический (Х=295нм), флуоресцентный (Х,=280/325нм), электрохимический, ПМР- [81] и масс-спектроскопический детекторы.
Большинство исследователей для разделения смесей всех восьми изомеров токоферолов и их ацетатов предпочитают использовать адсорбционную хроматографию. В этих случаях подвижной фазой обычно служат углеводороды, содержащие незначительные количества какого-либо простого эфира. Перечисленные методики определения витамина Е, как правило, не предусматривают предварительного омыления образцов, что существенно сокращает время выполнения анализа.
Разделение с одновременным количественным определением содержания жирорастворимых витаминов (А, Д, Е, К) при их совместном присутствии в поливитаминных препаратах проводят как на прямой, так и на обращенной фазах. При этом большинство исследователей предпочитают использовать обращенно-фазовый вариант ВЭЖХ. Метод ВЭЖХ позволяет анализировать водорастворимые витамины В1 и В2 как одновременно, так и отдельно. Для разделения витаминов используют обращенно-фазный, ион-парный и ионообменный варианты ВЭЖХ. Применяют как изократический, так и градиентный режимы хроматографирования. Предварительное отделение определяемых веществ от матрицы осуществляют путем ферментативного и кислотного гидролиза пробы.
Преимущества метода жидкостной хроматографии:
-Одновременное определение нескольких компонентов
-Устранение влияния мешающих компонентов
— Комплекс можно быстро перестроить на выполнение других анализов.
Состав и характеристика оборудования и программного обеспечения для жидкостного хроматографа «Хромос ЖХ-301»:
Таблица 1
Источник
[06-229]
Комплексный анализ на витамины группы B (B1, B2, B3, B5, B6, B7, B9, B12)
13825 руб.
Витамины группы В – водорастворимые витамины, жизненно важные микронутриенты, необходимые для нормального функционирования клеток, тканевого дыхания, метаболизма белков, жиров и углеводов, работы различных ферментных систем организма, окислительно-восстановительных процессов. Длительная недостаточность витаминов группы В может негативно влиять на здоровье человека и функции практически всех органов.
Синонимы русские
В-комплекс.
Синонимы английские
B vitamins, vitamin B complex.
Метод исследования
Высокоэффективная жидкостная хроматография с тандемным масс-спектрометрическим детектированием (ВЭЖХ-МС/МС); иммунохемилюминесцентный анализ.
Единицы измерения
Нмоль/л (наномоль на литр), нг/мл (нанограмм на миллилитр), пг/мл (пикограмм на миллилитр).
Какой биоматериал можно использовать для исследования?
Венозную кровь.
Как правильно подготовиться к исследованию?
- Детям в возрасте до 1 года не принимать пищу в течение 30-40 минут до исследования.
- Детям в возрасте от 1 до 5 лет не принимать пищу в течение 2-3 часов до исследования.
- Не принимать пищу в течение 8 часов до исследования, можно пить чистую негазированную воду.
- Не курить в течение 30 минут до исследования.
Общая информация об исследовании
Витамины группы В относятся к водорастворимым биологически активным веществам, необходимым для нормального протекания многих биохимических процессов. Эти вещества входят в состав коферментов, участвующих в окислительно-восстановительных реакциях, тканевом дыхании, синтезе белков, жиров и углеводов, образовании гормонов, росте и делении клеток, формировании тканей, защите от инфекций. Организм человека не способен самостоятельно синтезировать витамины, они не накапливаются (кроме витамина В12), и поэтому существует ежедневная потребность в поступлении данных веществ с пищей. В небольшом количестве они синтезируются микробиотой толстой кишки. Среди продуктов они содержатся в ржаном хлебе, злаках, зелени, гречке, бобах, орехах, дрожжах, яичном желтке, молоке, мясе, печени, почках, грибах, овощах и фруктах. При термической обработке содержание витаминов группы В в пище уменьшается. Также они разрушаются под воздействием алкоголя, никотина, кофеина. Избыток водорастворимых витаминов достаточно легко выводится из организма, поэтому гипервитаминоз развивается крайне редко.
Дефицит витаминов группы В возникает при несбалансированном и нерациональном питании, заболеваниях желудочно-кишечного тракта, которые сопровождаются нарушением всасывания питательных веществ, или при повышенном потреблении витаминов в метаболизме (например, при беременности, лактации).
Витамин В1 (тиамин-пирофосфат) является кофактором в реакциях декарбоксилирования аминокислот, превращения пирувата в ацетилкоэнзим А. При дефиците тиамина развивается болезнь бери-бери, которая характеризуется истощением, неврологическими поражениями (моторной и сенсорной полинейропатией, энцефалопатией Вернике), аритмиями, отеками, сердечной недостаточностью.
Витамин В2 (рибофлавин) необходим для образования и сохранения целостности эритроцитов, синтеза антител, процессов роста, тканевого дыхания. Совместно с витамином А витамин В2 обеспечивает целостность слизистых. Он способствует абсорбции железа и витамина В6 из пищи, снимает усталость глаз, предотвращает развитие катаракты.
Ниацин (витамин В3) участвует в жизненно важных окислительно-восстановительных реакциях, в метаболизме белков, жиров и углеводов, пуриновом обмене, тканевом дыхании, распаде гликогена. Он снижает содержание атерогенных (опасных) липидов в крови, расширяет мелкие кровеносные сосуды и улучшает микроциркуляцию. Удовлетворение потребности организма в ниацине также обеспечивается его синтезом бактериальной флорой кишечника из незаменимой аминокислоты триптофана при наличии витамина В6, рибофлавина и железа. При недостаточном поступлении ниацина поражаются кожа, органы пищеварения и нервная система. Дефицит витамина В3 приводит к пеллагре – смертельно опасному заболеванию, которое проявляется диареей, дерматитом, деменцией. При употреблении высоких доз витамина В3 возможна гиперемия кожи лица и верхней половины туловища, головокружение, парестезии, аритмии, диарея, сухость кожи и слизистой оболочки глаз, кожный зуд.
Витамин В5 (пантотеновая кислота) – компонент кофермента А, необходимого для обмена жиров и углеводов. Недостаточность данного витамина отражается на работе всех систем организма, особенно нервной, мышечной, на желудочно-кишечном тракте, выделительной системе и коже.
Витамин В6 (пиридоксаль-5-фосфат) является кофактором аминотрансфераз и декарбоксилаз. Дефицит пиридоксина сопровождается огрубением кожи, периферической нейропатией, болезненностью языка.
Витамин В9 (фолиевая кислота) необходим для нормального созревания эритроцитов. При его недостаточности развивается мегалобластная анемия. На фоне синдрома мальабсорбции дефицит витамина В9 возникает раньше других гиповитаминозов. Дефицит фолиевой кислоты в организме матери может стать причиной нарушения формирования нервной трубки у плода.
Витамин В12 (цианокобаламин) содержится в продуктах животного происхождения и способен накапливаться в организме. Нередко его недостаточность наблюдается у вегетарианцев. Его усвоение может нарушаться при заболеваниях желудка (аутоиммунном гастрите). Недостаточность витамина В12, как и фолиевой кислоты, приводит к мегалобластной анемии, но в отличие от нехватки В9 дефицит В12 вызывает фуникулярный миелоз – дегенеративное поражение спинного мозга.
По ряду различных причин может развиться дефицит как отдельных витаминов (например, арибофлавиноз, пеллагра, бери-бери), так и поливитаминная недостаточность, которая наблюдается чаще.
Для чего используется исследование?
- Для диагностики недостаточности/избытка витаминов группы В;
- для оценки сбалансированности питания.
Когда назначается исследование?
- При синдроме мальабсорбции на фоне заболеваний желудочно-кишечного тракта (целиакия, воспалительные заболевания кишечника, патология поджелудочной железы, состояния после резекции желудка и/или тонкой кишки);
- при клинических признаках недостаточности витаминов группы В (дерматиты, длительная диарея, эрозии и частые травмы слизистых, хейлиты, стоматиты, неврологические нарушения);
- при обследовании пациентов с гипотрофией, алкоголизмом или находящихся на парентеральном питании.
Что означают результаты?
Референсные значения
| Витамин В1 (тиамин-пирофосфат) | 82.0 — 239.0 нмоль/л |
| Витамин B2 (рибофлавин) | 116.0 — 393.0 нмоль/л |
| Витамин B3 (ниацин) | 13.0 — 161.0 нмоль/л |
| Витамин B3 (никотинамид) | 75.7 — 1081.0 нмоль/л |
| Витамин В5 (пантотеновая кислота) | 54.5 — 604.4 нмоль/л |
| Витамин В6 (пиридоксаль-5-фосфат) | 11.3 — 302.0 нмоль/л |
| Витамин B7 (биотин) | 0.025 — 5.647 нмоль/л |
| Витамин B9 (фолиевая кислота) | 3.1 — 19.9 нг/мл |
| Витамин В12 (цианокобаламин) | 180.0 — 914.0 пг/мл |
Причины повышения уровня витаминов B:
- пероральное или парентеральное введение препаратов витаминов группы В.
Причины понижения уровня витаминов B:
- недостаточное поступление витаминов в организм:
- неполноценное и несбалансированное питание (в том числе парентеральное);
- заболевания ЖКТ, сопровождающиеся синдромом мальабсорбции (патология поджелудочной железы, целиакия, муковисцидоз, персистирующая диарея (дольше 14 дней), болезнь Крона);
- анорексия;
- болезнь Хартнупа (наследственное заболевание, сопровождающееся нарушением усвоения некоторых аминокислот, в том числе триптофана);
- состояние после оперативного лечения заболеваний ЖКТ (например, гастрэктомии, резекции тонкой кишки, анастомозирования);
- гельминтозы (например, дифиллоботриоз, лямблиоз);
- состояния повышенного использования витаминов в метаболизме:
- длительная лихорадка;
- хронические инфекции;
- заболевания гепатобилиарной области (острые и хронические гепатиты, цирроз печени);
- гипертиреоз;
- новообразования;
- алкоголизм;
- беременность (особенно на фоне никотиновой и лекарственной зависимости, многоплодной беременности);
- период лактации.
Что может влиять на результат?
Прием витаминов и витаминсодержащих препаратов:
- Витамин В2. Снижают уровень рибофлавина в организме этанол, барбитураты, фенотиазин, трициклические антидепрессанты, препараты, блокирующие канальцевую секрецию, тиреоидные гормоны. Пробенецид и антихолинергические препараты могут увеличить абсорбцию рибофлавина из кишечника в кровь.
- Витамин В3. Уровень ниацина в организме снижают изониазид, фенитоин, вальпроевая кислота, азатиоприн, хлорамфеникол, циклосерин, флуороурацил, леводопа, меркаптопурин.
- Витамин В5. Его уровень в крови снижается при длительном приеме антибиотиков, сульфаниламидных препаратов.
- Витамин В6. Уровень пиридоксина снижается на фоне приема изониазида, L-дофы.
- Витамин В9. Его уровень уменьшается при приеме барбитуратов, фенитоина.
- Витамин В12. Оральные контрацептивы, колхицин, противосудорожные препараты, антибиотики понижают концентрацию В12.
Важные замечания
- Не рекомендовано выполнять исследование на фоне приема витаминов и витаминсодержащих препаратов, так как результаты будут недостоверными.
Также рекомендуется
- Водорастворимые витамины (B1, B5, B6, С)
- Жирорастворимые витамины (A, D, E, K)
- Копрограмма
- Общий анализ крови (без лейкоцитарной формулы и СОЭ)
- Аланинаминотрансфераза (АЛТ)
- Аспартатаминотрансфераза (АСТ)
- Глюкоза в плазме
- Фосфатаза щелочная общая
- Белок общий в сыворотке
- Холестерол общий
Кто назначает исследование?
Терапевт, гастроэнтеролог, дерматолог, офтальмолог, диетолог, акушер-гинеколог, педиатр, невролог.
Литература
- Fischbach F.T., Dunning M.B. A Manual of Laboratory and Diagnostic Tests, 8th Ed. Lippincott Williams & Wilkins, 2008: 1344 p.
- Escott-Stump S, ed. Nutrition and Diagnosis-Related Care. 6th ed. Philadelphia, Pa: Lippincott Williams & Wilkins; 2008.
- Sarubin Fragaakis A, Thomson C. The Health Professional’s Guide to Popular Dietary Supplements. 3rd ed. Chicago, Il: American Dietetic Association; 2007.
- Stipanuk, M.H. (2006). Biochemical, physiological, molecular aspects of human nutrition (2nd ed.). St Louis: Saunders Elsevier p. 667.
Источник