Методика определения водорастворимых витаминов вэжх

ГОСТ 32903-2014

Продукция соковая. Определение водорастворимых витаминов: тиамина (B1), рибофлавина (В2), пиридоксина (B6) и никотинамида (PP) методом обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии

ЖУРНАЛ АНАЛИТИЧЕСКОЙ ХИМИИ, 2010, том 65, № 1, с. 73-78

ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ =

УДК 543.544

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВОДОРАСТВОРИМЫХ ВИТАМИНОВ ГРУППЫ В И ВИТАМИНА С В КОМБИКОРМАХ, ПРЕМИКСАХ И БИОЛОГИЧЕСКИ-АКТИВНЫХ ДОБАВКАХ МЕТОДОМ ОБРАЩЕННО-ФАЗОВОЙ ВЭЖХ © 2010 г. А. О. Руденко, Л. А. Карцова

Санкт-Петербургский государственный университет, химический факультет 198504 Санкт-Петербург, Петродворец, Университетский просп., 26 Поступила в редакцию 06.10.2008 г., после доработки 02.03.2009 г.

Разработана методика определения водорастворимых витаминов группы В и витамина С в премиксах, биологически-активных добавках и комбикормах методом обращенно-фазовой ВЭЖХ в режиме градиентного элюирования с использованием гептансульфоната натрия в качестве ион-парного реагента. Разработана методика очистки экстрактов комбикорма методом твердо-фазной экстракции на колонке, заполненной сорбентом 8ер-Рак С18. Изучена устойчивость аскорбиновой кислоты и рибофлавина в водных растворах с различными значениями рН.

В настоящее время существует несколько основных методов определения витаминов в различных объектах. Наибольшее распространение получили хроматографические [1, 2], спектроскопические (ЯМР, УФ-спектроскопия) [3, 4] и электрофорети-ческие [5, 6] методы анализа. Водорастворимые витамины чаще всего определяют обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографией (ОФ ВЭЖХ) [7]. При анализе водорастворимых витаминов в качестве подвижных фаз обычно используют смеси метанол—вода в различных соотношениях с добавками триэтиламина или ион-парных агентов (гептилсульфонат натрия, октилсульфонат натрия или додецилсульфат натрия) [1].

Введение ион-парных агентов необходимо, поскольку водорастворимые витамины представляют собой гидрофильные соединения, проявляющие большую склонность к протонированию [8]. В качестве элюента используют также смеси ацетонит-рил—фосфатный буферный раствор, ацетонитрил — ацетатный буферный раствор в различных соотношениях [2].

Пробоподготовка реальных объектов при анализе водорастворимых витаминов обычно заключается в жидкостной экстракции витаминов разбавленным раствором HCl или метанолом [3]. Устойчивость некоторых витаминов (например, аскорбиновой кислоты) в метанольной среде выше, чем в водных растворах. Однако, такие витамины, как рибофлавин, в метаноле растворяются хуже, чем в воде [8]. При анализе сложных биологических и природных объектов возникает проблема очистки экстрактов. Наиболее эффективным методом очистки является твердофазная экстракция (ТФЭ) на различных сорбентах. [9]

Цель настоящей работы — разработка методики определения витаминов группы В и витамина С в премиксах, биологически-активных добавках и комбикормах.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

В работе использовали бидистиллированную воду, ацетонитрил (ос. ч.) («Криохром», Россия), KH2PO4 («Вектон», Россия), H3PO4 («Вектон», Россия), гептансульфонат натрия моногидрат («Ald-rich», США), а также стандарты витаминов («Sigma», США), сорбенты для твердофазной экстракции: активированный уголь (Россия), XAD2 Amberlite (Supelco, США), Sep-Pak C18 (Waters, США).

Определение витаминов проводили на жидкостном хроматографе Shimadzu LC-20 Prominence, (Япония) с УФ-детектированием (260 и 280 нм). Хроматографическая колонка 250 х 4.6 мм Supelco С18 зернением 5 мкм (США). Хроматографировали в градиентном режиме при расходе элюента 1 мл/мин (табл. 1). В качестве подвижной фазы использовали смесь 11.0 мМ фосфатного буферного раствора с рН 2.5, содержащего 4 об. % ацетонитрила и 10.5 мМ гептансульфонат натрия (компонент А) и ацетонитрил (компонент В).

Использовали стандартные образцы следующих витаминов: аскорбиновая кислота (С), никотиновая кислота (В3 или РР), никотинамид (В3 или РР), пиридоксин гидрохлорид (В6), рибофлавин (В2), тиамин гидрохлорид (В1) (рис. 1). Растворы для построения градуировочного графика готовили последовательным разбавлением исходной концентрированной смеси указанных витаминов.

Таблица 1. Условия градиентного элюирования

Время, мин Объемная доля компонента, %

А В

0.01 93 7

6.5 93 7

9 82 18

13 82 18

17 50 50

19.5 50 50

22 93 7

25 93 7

При определении витаминов в премиксах, комбикормах и БАД образцы экстрагировали 25 мл 0.01 М раствора соляной кислоты при 40°С в течение 10 мин. Полученную взвесь центрифугировали в течение нескольких мин при 8000 об/мин. С целью снижения фонового сигнала, удаления примесей и сопутствующих компонентов, а также получения удовлетворительных значений разрешения RS пиков экстракт комбикорма очищали методом твердофазной экстракции. Изучены различные сорбенты: XAD2 ЛшЪегШе, Supelco (60 мкм, емк. 10.5%),

Sep-Pak C18, Waters (20 мкм, емк. 12%) мелкораздробленный активированный уголь (БАО) с диаметром гранул 1.5 мм и полистирол (100 мкм). Экстракт очищали на стеклянной колонке с внутренним диаметром 4—5 мм, заполненной сорбентом на высоту 3—4 см. Поверх сорбента помещали фильтр из стекловаты. Сорбент предварительно промывали 5 мл метанола и 5 мл дистиллированной воды. Затем в колонку вводили 3 мл экстракта комбикорма и пропускали его через колонку под вакуумом водоструйного насоса со скоростью ~0.5 мл/мин. Сорбент промывали 1 мл дистиллированной воды. Витамины десорбировали 3 мл метанола. Полученный элюат упаривали под вакуумом досуха и растворяли в 1 мл элюента. Вследствие высокого содержания примесей в экстракте комбикорма сорбент в колонке использовали один раз. Очищенные экстракты фильтровали через мембранный фильтр с диаметром пор 0.45 мкм («Supelco», США). Для определения коэффициентов извлечения в экстракт комбикорма вводили добавку стандартной витаминной смеси до процедуры очистки и анализировали экстракты с добавкой и без добавки. Коэффициент извлечения а определяли по формуле

а =

( S — So ) V V

ад v4 ,

(1)

где: и S1— средняя площадь пика компонента в пробе без добавки и с добавкой соответственно, см2; У1 — конечный объем очищенного экстракта (1 мл), к — градуировочный коэффициент компонента; с0 — концентрация компонента в добавленном растворе ( 0.2 мг/мл),; У2 — объем добавленного рабоче-

CO-

C-OH и

C-OH

H-HO-

-о—

H

CH2OH I

H3C H3C

N

O

OH

II

CH2OH

I 2

CHOH CHOH CHOH

CH2

I 2

C

Л .NH

N C

II

O

N

Г

O

O

V

nh2

N

CH2OH HOH2C OH

CH3

III

N IV

© ch3

гч 1

N-CH H2 C>/C=C-CH2CH2OH H3C^ У—C-N ‘

N:

HC-S

nh2

VI

Рис. 1. Структуры определяемых витаминов: I — аскорбиновая кислота, II — никотиновая кислота, III — никотинамид, IV — пиридоксин, V — рибофлавин, VI — тиамин

го раствора витаминов (3 мл), У3 — суммарный объем экстрагента (25 мл), У4 — объем очищаемого экстракта (3 мл). Коэффициенты извлечения витаминов в составе комбикорма ПК-5 приведены в табл. 2.

Хроматограммы экстрактов реальных объектов приведены на рис. 2—4.

Массовую долю витаминов в комбикормах, премиксах и БАД (Х,, мг/кг), вычисляли по формуле

Таблица 2. Коэффициенты извлечения витаминов на сорбенте Sep-Pak C18 (n = 5, P = 0.95)

X =

сУк n

m н а

(2)

где с — концентрация витамина, полученная по гра-дуировочному графику, мг/см3; Ук —объем HCl, используемый для экстракции (25 мл).

n — для премиксов и БАД степень разбавления хроматографируемой пробы соляной кислотой в случае выхода за пределы верхнего диапазона определяемых содержаний; n — для комбикормов степень упаривания метанольного экстракта; тн — навеска пробы, взятая для экстракции, кг; а — коэффициент извлечения.

В специальных экспериментах определяли стабильность аскорбиновой кислоты и рибофлавина. Эти витамины наиболее чувствительны к воздействию света и значению рН среды. При длительном хранении градуировочных растворов различной концентрации, приготовленных на бидистиллиро-ванной воде, наблюдали значительное снижение концентрации указанных витаминов.

Витамин а

Никотиновая кислота 0.77 ± 0.04 0.03

Никотинамид 0.86 ± 0.05 0.04

Пиридоксин 0.75 ± 0.04 0.03

Тиамин 0.86 ± 0.05 0.04

Рибофлавин 0.94 ± 0.03 0.03

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Условия градиентного элюирования оптимизировали экспериментально с использованием модельных смесей. Оптимальное разделение наблюдается при содержании ацетонитрила в элюенте 12об.% (табл. 3).

Введение в подвижную фазу гептансульфоната натрия (ион-парный реагент) позволило полностью разделить пики.

Активированный угль и полистирол непригодны в качестве сорбентов для очистки экстрактов мето-

Усл. 1100 1000 900 800 700 600 500 400 300 200 100 0

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 мин

Рис. 2. Хроматограмма экстракта биологически-активной добавки «АлфаВит»: 1 — аскорбиновая кислота, 2 — никотиновая кислота, 3 — никотинамид, 4 — пиридоксин, 5 — рибофлавин, 6 — тиамин. Условия хроматографирования: колонка (250 х 4.6 мм) 8ире1ео811 С18 (5 мкм), элюент—фосфатный буферный раствор с рН = 2.5, ацетонитрил, длина волны детектора 260 нм, расход элюента 1 мл/мин.

Усл. ед. 275

250

225

200

175

150

125

100

75

50

25

20.0 7, мин

Рис. 3. Хроматограмма экстракта премикса П-50: 1 — никотиновая кислота, 2 — никотинамид, 3 — пиридоксин, 4 — рибофлавин, 5 — тиамин. Условия хроматографирования указаны в подписи под рис. 2.

дом ТФЭ. На сорбенте ХАЛ2 АшЪегШе удалось очистить экстракт от слабоудерживаемых примесей, однако пиридоксин (В6), тиамин (В1) и аскорбиновая кислота практически не удерживались. Лучшие результаты по эффективности очистки и коэффициентам извлечения показал обращенно-фазовый сорбент 8ер-Рак С18, благодаря которому удалось значительно снизить пределы обнаружения аналитов, а также получить удовлетворительные результаты по коэффициентам извлечения (табл. 2) и разрешению (табл. 3). При этом установлено, что колонка с сор-

бентом 8ер-Рак С18 для ТФЭ не выдерживает многократного использования.

Аскорбиновую кислоту вследствие ее высокой гидрофильности и слабой устойчивости в водных растворах определить в этих условиях не удалось. Коэффициенты извлечения имели крайне низкое значение (~30%) и не воспроизводились от пробы к пробе. Изучена устойчивость водорастворимых витаминов — аскорбиновой кислоты и рибофлавина — в водных средах с различными значениями рН при температуре 20°С (рис. 5). Установле

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.